circRNA：环状RNA的前世今生以及临床研究思路
摘要：1976年circRNA分子被发现，经过30多年的沉寂后，在2013年一鸣惊人，并在随后几年时间里迅速成为新一代明星分子。接下来介绍circRNA定义、circRNA的发现、circRNA的主要特征、circRNA的形成模式、circRNA的作用机制、circRNA常用数据库以及重点介绍circRNA的研究思路。
一、circRNA的定义
circRNAs（CircularRNAs，环形RNA分子）是一类不具有5‘ 末端帽子和3’ 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。
二、circRNA的发现
1976年，在电子显微镜下观测到真核细胞的细胞质中存在环状RNA分子。
1993年，在小鼠中发现其Sry基因存在环状转录。
2012年，借助于高通量测序技术，circRNA被大量发现。
2013年，Nature杂志同一期刊登两篇circRNA研究文章（图1，图2），自此circRNA相关研究快速增长，逐渐成为非编码RNA领域新的明星分子。
图1--circRNA是一大类具有调控作用的动物RNA分子
图2--天然circRNA分子作为miRNA海绵而发挥作用
circRNAs能隐藏这么多年不为人所知，主要因为以下几个原因：
1、当使用线性基因组作为引物设计模板时，传统的逆转录酶-rtPCR无法区分环状和线性RNA。
2、circRNA没有映射到线性参考基因组，所以在测序数据中，序列读取的序列会被丢弃。
3、circRNA缺少polyA尾巴，而RNA测序文库制备时通常都会去除rRNA的polyA。
三、circRNA主要特征
1、circRNA由特殊可变剪切产生，大量存在与真核细胞的细胞质中，主要来源于外显子，少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中。
2、表达水平具有种属、组织、时间特异性。
3、circRNA呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更加稳定。
4、具有一定序列保守性。
5、在转录或转录后水平发挥调控作用。
6、绝大多数circRNA是非编码的，但也有少数可以翻译为多肽。
四、circRNA的形成模式
circRNA根据其来源可分为三类：外显子来源的circRNA(exonic circRNAs)，内含子来源的circRNA(circular intronic RNAs， ciRNAs)，以及由外显子和内含子共同组成的circRNA(retained-intron circRNAs)。
circRNAs的形成不同于线性RNA的标准剪切模式，是通过backsplicing方式剪切而来。现有的circRNA形成模型主要由以下5种（图3）：
1、exon skipping；
2、direct backsplicing；
3、环状内含子RNA(ciRNAs)形成模式；
4、依赖于RBPs环化模式；
5、类似于可变剪切的可变环化模式。
图3--circRNA形成模式
五、circRNA的作用机制
circRNA曾一度被认为是正常拼接过程的错误。近年来，circRNA相关研究爆炸式增长，circRNA被发现是正常细胞分化和组织稳态以及疾病发展中的重要参与者，而且circRNA的表达通常不与宿主基因表达相关。这表明circRNA不仅仅是mRNA剪接的稳态副产物，而是新型调控的可变剪接的产物。 序列保守性分析也证明circRNA具有重要的非编码功能。
1.miRNA分子海绵，circRNA含有大量的miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达（图4）。例如第一个被揭示具有调控功能的circRNA--ciRS7，它作为miR7的海绵，含有miR7的470个保守结合位点。ciRS7在人体的许多组织中稳定表达，通过抑制miR7活性来增加miR7靶基因的表达水平。而miR7直接靶向几种致癌基因，涉及许多不同的人类癌症。
图4--circRNA对miRNA的调控
2.调控基因转录，circRNA也可以通过与RNA结合蛋白的结合来调控蛋白功能，比如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录。
3.编码功能，circRNA虽然属于非编码RNA，但是也有少数circRNA可以编码多肽，通过该多肽行使调控功能。
浙江大学生科院陈铭教授开发了一个预测分析circRNA翻译多肽的工具：CircPro（图5）。下载地址： http://bis.zju.edu.cn/CircPro。
图5--陈铭教授circRNA翻译多肽预测工具的文章
六、circRNA常用数据库
circRNA研究常用数据库，BioWorld之前做过整理，点击这里查看：circRNA研究之：circRNA常用数据库介绍
七、circRNA的研究思路
上文介绍了circRNA的三种作用机制，作为miRNA的海绵；调控基因转录；编码多肽。接下来重点讲述第一种作用机制的研究思路。
1、 验证 circRNA 的表达水平；
2、通过网络数据库， 预测 circRNA 可能结合的 miRNAs；
3、circRNA 结合的 miRNAs 的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证；
4、miRNA 靶基因预测与功能富集分析；
5、miRNA 靶基因的筛选、 验证及相关功能研究；
6、circRNA-miRNA-mRNA 调控网络的验证。
2017年10月16日，中山大学肿瘤防治中心唐海林教授和中南大学肿瘤研究所曽朝阳副研究员作为共同通讯作者在J. Exp. Clin. Cancer Res杂志发表题为circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triple negative breast cancer by regulating miR-34a的文章（图6）。我们以此文为例，分析circRNA的研究思路。
图6
我们先看结论：circGFRA1可作为一种竞争性内源性RNA(ceRNA)，通过作为mirR-34a海绵来调节GFRA1表达，在三阴性乳腺癌（TNBC）中发挥调控功能。
1、寻找差异表达的circRNA
首先通过微阵列分析了TNBC细胞系中circRNAs的表达谱，找到了显著表达上调circRNA--circGFRA1（图7）。
2、验证临床组织样本表达差异
验证分析临床组织样本后发现，circGFRA1被上调，与TNBC的不良临床结果相关（图8）。
3、细胞功能验证及动物实验
通过siRNA下调circGFRA1的表达，发现可以显著抑制了TNBC细胞的生长。凋亡分析表明，circGFRA1的下调显著促进了TNBC细胞的凋亡。通过裸鼠成瘤实验发现，circGFRA1的下调导致肿瘤生长显著降低。所有这些发现表明，circGFRA1可以促进TNBC的增殖和抑制细胞凋亡（图9）。
4、circRNA-miRNA调控关系验证
首先确认了circGFRA1主要分布在细胞质中。随后，通过数据库预测miR-34a的潜在结合位点在circGFRA1序列中。进行荧光素酶报告基因确定miR-34a可以直接靶向circGFRA1的3′UTR。rt-qPCR、RIP实验证实circGFRA1在功能上是作为miR-34a海绵（图10）。
图10
5、ceRNA机制验证
检测GFRA1在乳腺癌中的表达，发现GFRA1在TNBC细胞系(图11A)和组织中(图11B)均上调。
使用TargetScan确定miR-34a和GFRA1的预测靶向基因(图11C)。
通过荧光素酶报告基因实验确认miR-34a直接靶向GFRA1(图11D)。
分析rt-qPCR和WB数据证实miR-34a抑制GFRA1的表达(图11E、11F)。
敲低GFRA1后，miR-34a表达上调(图11G)。
以上实验证实GFRA1是miR-34a的直接目标。
敲低circGFRA1后，GFRA1的表达被抑制(图11H)。将miR-34a抑制剂和sicircGFRA1共转染到TNBC细胞系中，观察到抑制作用发生了逆转(图11H)。
敲低GFRA1后，circGFRA1的表达被抑制(图11I)。共转染miR-34a抑制剂和siGFRA1后，circGFRA1的表达恢复(图11I)。
以上实验说明circGFRA1和GFRA1通过吸附miR-34a作为ceRNA来调控TNBC的发展。细胞增殖实验和凋亡分析说明，miR-34a联合circGFRA1下调进一步抑制TNBC细胞生长，促进TNBC细胞凋亡(图11J、11K)。
图11-ceRNA验证
总的来说，本文思路清晰，数据翔实，可以当作circRNA研究的5分文章模板来学习。微信后台回复关键词“GFRA”，即可收到这篇文章。
参考文献：
1、Kristensen L S,Hansen T B,Venø M T et al. Circular RNAs in cancer: opportunities and challenges in the field.[J] .Oncogene, 2017.
2、Memczak Sebastian,Jens Marvin,Elefsinioti Antigoni et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.[J] .Nature, 2013, 495(7441): 333-8.
3、Hansen Thomas B,Jensen Trine I,Clausen Bettina H et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.[J] .Nature, 2013, 495(7441): 384-8.
4、Meng Xianwen,Chen Qi,Zhang Peijing et al. CircPro: an integrated tool for the identification of circRNAs with protein-coding potential.[J] .Bioinformatics, 2017, 33(20): 3314-3316.
5、Piwecka Monika,Glažar Petar,Hernandez-Miranda Luis R et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function.[J] .Science, 2017, 357(6357).
6、Guarnerio Jlenia,Bezzi Marco,Jeong Jong Cheol et al. Oncogenic Role of Fusion-circRNAs Derived from Cancer-Associated Chromosomal Translocations.[J] .Cell, 2016, 165(2): 289-302.